单抗药物血药浓度定量检测案例

药物代谢动力学 (Pharmacokinetic, PK) 是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化规律的一门学科。血液是药物及其代谢物在体内吸收、分布、代谢和排泄的媒介，各种体液和组织中的药物浓度与血液中的药物浓度保持一定的比例关系，所以血药浓度变化最具有代表性，是最常用的样本。为助力抗体药物临床前和临床药代动力学研究，设计一种精准的实验方法测定血药浓度就显得尤为重要。
目前，最常用的单抗浓度测定技术是酶联免疫吸附实验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)。本文将给大家介绍三种最具代表性的ELISA方法。
三种单抗药物血药浓度定量检测方法优劣势对比（以PD-1抗体为例）：

案例一、间接法测定PD-1抗体药血药浓度
检测方法：ELISA
检测仪器：BMG CLARIOSTAR酶标仪
样本信息：PD-1抗体药血清样本
主要试剂：
Human PD-1蛋白 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H5221)
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson, Cat.No. 109-035-098)
简要流程：
1. 将human PD-1 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H5221) 以0.1ug/well的浓度包被到板上；
2. 将PD-1抗体药梯度稀释到人血清中；
3. 将稀释过的PD-1抗体药加到孔板中；
4. 加入Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG二抗；
5. TMB显色。
检测结果：
为避免非特异背景干扰，该方法血清样本进行了1000倍稀释，因此血清样本检测范围0.19-6.25ug/mL，检测灵敏度0.19ug/mL（见图1）。

图1. 间接法测定PD-1抗体药血药浓度标准曲线
案例二、抗体竞争法测定PD-1抗体药血药浓度
检测方法：ELISA
检测仪器：BMG CLARIOSTAR酶标仪
样本信息：PD-1抗体药血清样本
主要试剂：ELISA Assay Kit for Anti-PD-1 h-mAb in Human Serum (ACROBiosystems, Cat.No. EPH-V1)
简要流程：

1. 将human PD-1以0.1ug/well的浓度包被到板上；

2. 将梯度稀释的PD-1抗体药和biotinylated anti-PD-1 antibody混合（血清终浓度10%）；

3. 将混合物加到孔板中；

4. 加入Streptavidin Protein, HRP二抗；

5. TMB显色。

检测结果：
该方法血清样本检测范围0.78-25ug/mL，检测灵敏度0.78ug/mL（见图2）。


图2. 抗体竞争法测定PD-1抗体药血药浓度标准曲线

案例三、配体竞争法测定PD-1抗体药血药浓度
检测方法：ELISA
检测仪器：BMG CLARIOSTAR酶标仪
样本信息：PD-1抗体药血清样本
主要试剂：
Human PD-L1蛋白 (ACROBiosystems, Cat. No. PD1-H5258)
Biotinylated human PD-1 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H82F2)
Streptavidin Protein, HRP (Thermo, Cat.No. 21126)
简要流程：

1. 将human PD-L1 (ACROBiosystems, Cat.No. PD1-H5258) 以0.2ug/well的浓度包被到板上；

2. 将梯度稀释的PD-1抗体药和biotinylated human PD-1混合（血清终浓度10%）；
3. 将混合物加到孔板中；
4. 加入Streptavidin Protein, HRP二抗；
5. TMB显色。
检测结果：
该方法血清样本检测范围1.565-6.25ug/mL，检测灵敏度1.565ug/mL（见图3）。

图3. 配体竞争法测定PD-1抗体药血药浓度标准曲线
 
案例分析对比：

图4. 比较间接法和抗体竞争法检测不同人给药前血清样本中的PD-1抗体浓度。

比较上文三个案例，案例三配体竞争法线性范围较窄，导致样本稀释过于繁琐，且准确性较低。案例一间接法和案例二抗体竞争法相比，线性范围接近，灵敏度接近。但是，案例一间接法所用二抗为Goat anti-human IgG，在血清中会有非特异性背景干扰，而案例二抗体竞争法使用和生物素结合的Streptavidin Protein, HRP作为检测二抗，避免背景干扰（见图4）。
 
为了支持上述研究，ACROBiosystems公司采用案例二的抗体竞争法，开发了一系列ELISA血药浓度定量检测试剂盒，用于测定临床前和临床血液样本中的抗体药浓度。该系列产品经证实具有低背景、通用快速、高批间一致性等卓越的实验表现。
产品特点
低背景
由于血清背景干扰，可能会产生假阳性结果，因此，确定最小稀释倍数 (MDR) 对实验至关重要。实验过程中需要用缓冲液对样本进行一定的稀释，使实验结果达到最优的精密度，消除基质干扰。在间接ELISA中，需要对血清进行1000倍稀释才能消除假阳性。为了避免过度稀释产生误差，ACROBiosystems利用一系列生物素标记抗体来降低血清非特异性干扰导致的假阳性。
通用快速
在PD-1血药浓度检测试剂盒中，我们成功验证了五种已经上市或临床阶段的治疗性PD1抗体。


PD-1血药浓度检测试剂盒验证五种治疗性PD-1抗体。

我们采用生物素标记抗体来和血样中待测治疗用抗体药物进行专一特异的竞争，避免了常规夹心法所必须的抗体药ADA的开发，极大的缩短血药浓度分析方法建立的周期。
高批间一致性
我们具有严格的质量控制措施，确保产品批间一致性。新产品会通过多种实验方法与我们内部标准进行平行对比，只有差异在可接受范围内的产品才会被放行。
高稳定性
为确保产品稳定性，ACROBiosystems会做加速实验、冻融实验和长期稳定性实验来验证产品稳定性。只有经过测试证实质量和活性没有任何影响的产品才会被放行。

PD-1血药浓度检测试剂盒各产品组分按照说明书重构后，37℃放置2小时，活性无显著差异。根据加速实验换算方法，该产品能够在-80 °C放置4.6个月。

PD-1血药浓度检测试剂盒各产品组分按照说明书重构后，反复冻融1-2次，活性无显著差异。
丰富的产品线
ACROBiosystems开发了一系列ELISA血药浓度定量检测试剂盒，可检测包括PD-1抗体，HER-2抗体，CTLA-4抗体，VEGF抗体，TNFα抗体，CD20抗体和EGFR抗体等多种抗体药物的血药浓度。
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