液相色谱法测定维生素A、维生素D3（VA和VD3）

液相色谱法测定维生素A、维生素D3（VA和VD3）

维生素A（VA）、维生素D3（VD3）、维生素E（VE）和β-胡萝卜素是维持人体正常生理活动和机能的脂溶性维生素，缺乏这些维生素会导致多种疾病。流行病学研究资料表明，脂溶性维生素与癌症发生有着相应的关系

  食道癌是世界八大癌症之一，而我国又是食管癌的高发地区，每年因食管癌死亡者约15万人，但有关食道癌与脂溶性维生素的关系尚无相关报道。通过测定和比较食道癌病人和正常人血清中脂溶性维生素的含量，可以了解食道癌与脂溶性维生素的关系，为指导病人正确地补充维生素

提供实验室依据。目前我国尚无测定血清中脂溶性维生素的标准方法。

HPLC因其具有高分离效能、灵敏快速、可自动化等优点，已经广泛用于食品等样品中脂溶性维生素的测定，而同时测定人血清中VA、VD3、VE和β-胡萝卜素四种脂溶性维生素的报道甚少。因此，本课题组拟建立HPLC同时测定VA、VD3、VE和β-胡萝卜素的方法，并应用于食道癌病人和正常人血清样品的测定，为研究食道癌的发生与血清中脂溶性维生素之间的关系提供简单可行的实验技术和数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂液相色谱仪附紫外检测器、吹氮仪、视黄醇、维生素D3、α-生育酚和β-胡萝卜素标准品  1mg/ml

维生素标准贮备液配制：分别精密称取视黄醇、VD3、α-生育酚、β-胡萝卜素各0.025g于25ml容量瓶中，视黄醇、VD3和α-生育酚用甲醇，β-胡萝卜素用二氯甲烷溶解并定容到刻度，摇匀备用。

1.2 

实验方法

1.2.1 

色谱条件   色谱柱：C18柱；柱温25℃；流动相：甲醇:二氯甲烷:乙腈（10:20:70）；流动相程序：

0~12min  流速1.0~1.5ml/min  线性变化，12min~17min  保持流速 1.5ml/min，17min

流速回到1.0ml/min；检测 波长切换程序：0~6min为324nm，6min~8 min为263nm，8~12min为291nm，12min后为462nm; 1.2.2 标准曲线的绘制分别取适量维生素标准溶液，用流动相稀释成浓度不同的标准系列，10μl进样测定，以维生素标准溶液浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线或进行线性回归。

1.2.3 样品测定0.2ml血清中加入0.2ml无水乙醇沉淀蛋白质，0.8ml已醚/石油醚混合溶液提取，振摇1min后15000r/min离心2min；取上清液0.6ml，氮气吹干，0.10ml流动相溶解残渣，漩涡振荡器振荡30s，15000r/min离心2min，取25μl上清液进样测定。